这篇Nature,实现单分子电化学反应光

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原创丨彤心未泯（学研汇技术中心）

编辑丨风云

化学反应倾向于从单个分子转化为产物的角度来理解，但通常是在探测物质时观察到整体的平均行为。单分子方法超越了系统平均，揭示了反应位置、途径和动力学的统计分布。这一点已在现代光学方法得到证明。然而，单分子溶液化学的有效探索仍然具有挑战性。

基于此，浙江大学化学系的冯建东教授团队利用了钌络合物在电极上电化学生成的化学发光反应，确保了最小的背景信号，展示了在水溶液中单分子电化学反应的光学成像及其在超分辨率显微镜中的应用。该方法能够直接捕获单个反应的电化学发光的单个光子，并开发超分辨率的电化学发光显微镜，以高时空分辨率成像活细胞的粘附动力学。预计该方法将促进对电化学反应的基本理解，并被证明对生物测定和细胞成像应用有用。

电化学发光反应

提高分析的分辨率

实验是通过在观察通道中隔离电化学发光（ECL）反应来进行的，在这个观察通道中，单分子ECL反应只能发出一个光子。作者采用了一个广泛探索的模型ECL体系——将三联吡啶钌(II)和Ru(bpy)32+作为反应物，在铟锡氧化物(ITO)电极表面生成Ru(bpy)33+，体系中的共反应物三丙胺(TPrA)产生自由基TPrA·，与Ru(bpy)33+反应再生Ru(bpy)32+并释放光子(hυ=2eV)。该体系通过式(1)、式(2)所示的氧化-还原机理产生ECL。

整体反应将大量ECL反应相加，并给出发射光强度的平均值。此外，尽管ECL过程在单个纳米颗粒表面的空间隔离提供了关于纳米颗粒碰撞的随机信息，并使其能够成像，但观察水溶液中的单分子ECL反应需要在空间和时间上隔离单个反应。作者开发了一种组合的宽场光学成像和电化学记录系统（见图1a），用于监测水溶液中单分子钌基ECL反应。ECL反应由一个典型的三电极电化学电池触发和控制，该电池产生工作电压，并用低噪声电流放大器记录电化学电流。使用一个薄的ITO电极（图2、3），通过倒置显微镜进行同步电化学测量和光学成像。随着电压的施加，反应发生在透明ITO电极的表面，发射的光子由底部高数值孔径物镜反收集，然后由高效率、低读出噪声的电子倍增电荷耦合器件相机检测。图1b所示的循环伏安法和ECL强度数据揭示了钌络合物作为电压函数的电化学反应过程。发光信号及其峰值为nm（2eV）的发射光谱（图1c）表明，收集的光子是由ECL反应产生的。如图1d-g所示，在施加1.4V电压后，记录在单个图像像素上的光子强度表现出随机的开关行为，这是单个分子反应的典型特征。电压的可逆切换表明随机光信号受电压控制。有无电压施加的轨迹的功率谱密度分析在图4-6中给出，其中信号在低频带中被捕获。

图1单分子ECL成像装置和随机反应的观察

图2ITO样品制备方案

图3溅射ITO薄膜的厚度表征

图4功率谱密度谱中的信号和背景噪声

图5不同浓度1.2V下的功率谱密度分析

图6不同曝光时间1.2V下的功率谱密度分析

接着，作者探索了这些反应的光子计数统计。引人注目的是，图1f显示了从这些突发事件中发射的离散数量的光子。检测到的事件从摄像机偏移(ECL的背景)中清晰地分辨出来，信噪比大于5。基于光信号的可逆性（图1g）、与测量的电化学电流（图1d）、发射光谱（图1c）的良好同步性以及光子数（图1f）与反应机理（方程式（1）、（2））的对应性，可以将离散光子信号归因于单个ECL反应。因为快速的摄像机记录和溶液中反应物的稀释确保了反应在时间和空间上的充分分离，最终实现了单个反应的观察。这如图7所示，其中增加曝光时间可导致从观察稀疏单分子事件到相机饱和的转变。假设单分子在电极表面的碰撞服从随机过程，可以用泊松分布拟合光子数（图8）。

图7不同暴露时间单分子反应的观察

图8不同曝光时间的光子计数分布

钌基电化学反应可以是动力学控制或扩散控制，通过分析两个相邻事件之间的间隔时间（τoff）获得动力学信息（图9a）。在发射光子之前，Ru(bpy)32+首先扩散到电极表面，然后开始反应。因此，反应物的浓度在实现单分子观察中起着关键作用，观察事件之间的间隔时间τoff与钌络合物浓度成反比（图9b），每个图像帧观察到的事件数量与浓度成线性比例（图9c）。图9c中的线性关系与实验系统中裸ITO表面被全面扩散控制的反应一致，尽管有可能是由于电极表面的纳米级不均匀性和施加的电压造成的一些局部动力学控制（图10）。由于共反应物TPrA通常保持在较高的摩尔浓度(50mM)，作者主要研究基于Ru(bpy)32+的ECL路线，只考虑Ru(bpy)32+分子的影响。电场作用下的分子碰撞频率可以用一个改进的Smoluchowski扩散模型定量描述，该模型将碰撞频率与Ru(bpy)32+浓度联系起来。图9c表明，在1.4V的三次连续扫描过程中，观察到的每帧事件数随浓度的增加趋势减小。为了探索这一点，作者通过标准计时电流测量和Cottrell方程拟合来确定有效ITO面积，发现扫描之间ITO面积显著减少（图11）。这可能是由于ITO表面的纳米级不均匀性以及由于TPrA反应产物的不可逆吸收或ITO表面的形态变化而导致有效反应位点耗尽的重复扫描。最小的背景信号（因为不需要激光来产生发射）和光学解析单光子ECL信号的能力意味着该方法可以直接检测单个电化学反应，其灵敏度尚未用当前的单粒子电化学方法证明。另外，由于Ru(bpy)32+/TPrA系统的有限ECL效率以及光学装置的有限光子收集和检测效率，并不是所有反应都能被观察到，因此希望通过探索更高效的ECL系统和更高效的双目标光学装置，可以进一步提高系统的灵敏度。

图9单分子ECL反应动力学分析

图.2V下不同浓度的每帧事件数和间隔时间

图11ITO电极的电化学计时电流测量

由于能够光学检测单分子反应并对其空间位置进行成像，作者将定位显微镜的基本原理应用于ECL反应位点映射。ITO表面上的反应位点多次受到溶液中Ru(bpy)32+分子扩散的影响（图12a），因此在重复的单分子碰撞后，大量ECL反应局部化累积。这种累积提高了单个反应位点的定位精度。成像能力的基准测试是在一个微加工的ITO电极模板上进行的，该模板通过高分辨率电子显微镜、元素映射分析和高度分析进行表征（图12b，图13,14）。然后在同一样品上进行单分子ECL。虽然单个事件的定位精度较低，因为在一个突发事件中仅捕获一个或几个光子，但在同一反应位置的重复碰撞会导致多个定位簇（图12f），这使得能够以秒的采集时间重建ITO表面图像（图12d）。扫描电子显微镜（图12b，c）和超分辨ECL图像（图12d，e）显示的空间模式之间的相关性非常好，验证了该方法。在激发的Ru(bpy)32+的长寿命期间（在25°C水中约为0.64μs），它可以在发射光子之前从反应位置扩散约20nm，因此检测位置可能与反应位置不同。使用标准傅里叶环相关（FRC）方法对图像分辨率进行量化，可获得低至22nm的分辨率（图12g）。定位分析还包含定量信息，反映在不同区域的定位分子数量上（图12h）。这些发现证明了一种不需要激光激发的超分辨率显微镜。尽管成像仍然局限于表面，但涉及使用分离光束路径或点扩散函数工程的策略可能允许三维成像。基于ECL的成像方法的一个独特功能是背景最小化到相机偏移水平，因为不使用光激发，为分辨单个光子提供超高灵敏度。此外，单分子ECL可以通过最终驱动光子发射的外加电压进行时空控制，以满足动态成像要求。

图12ITO结构的单分子ECL成像

图13纤维图案化ITO的SEM成像和EDS元素映射

图14FIB图案化ITO样品的AFM表征

接下来作者探索了用于细胞成像的单分子ECL。细胞与细胞外基质的粘附是许多基本生物学过程中的一个重要过程，如细胞迁移和增殖。活细胞粘附成像需要一种具有良好空间分辨率的技术，以可视化局部粘附，并具有足够的时间分辨率。超分辨率荧光显微镜虽然可以满足这些要求，但必须用荧光标记粘附蛋白，可能会干扰活细胞。ECL显微镜已被证明不需要直接标记细胞成像，但其分辨率太有限，无法解析更详细的粘合结构。当使用单分子ECL直接在ITO表面（图15a）上成像单个细胞时，细胞的粘合区域可防止ECL反应物扩散到ITO表面上的反应位点。与暴露的ITO表面相比，这会导致暗对比，从而在不直接标记粘附蛋白的情况下解析细胞粘附位点。随后细胞粘附的成功成像通过相同固定细胞的对比超分辨率荧光成像和单分子ECL成像得到证实。这表明，前者在局灶性粘附时显示标记的蛋白质簇，而后者则显示整体细胞粘附。由于ECL信号的灵敏度和动态控制，可以有效地利用ECL信号进行快速图像重建。图15b、d显示了活体人类胚胎肾（HEK）细胞的超分辨ECL图像，显示了与亮场图像（图15a）和衍射受限ECL图像相比的特定信息（图15c）。作者进一步探索了细胞粘附的动态过程，并观察了粘附区域的运动，FRC映射确定的时间分辨率为12s，空间分辨率为nm，这与优化的聚焦粘附超分辨率荧光显微镜成像相当。通过对动态过程的分析（图15g），获得了所选粘合区域移动的平均速度为2.28μm2min?1(图5e中的区域)，最小为1.70μm2min?1(图5f中的区域)。

总之，作者开发了一种利用电化学发光实现单分子反应的观察，并实现了细胞结构的有针对性的可视化。与荧光显微镜一样，通过捕获固定探针分子多次激发过程中发射的光子进行信号放大，可以进一步提高该方法的成像能力和特异性。尽管ECL避免了激光诱导的问题（如光漂白和自体荧光）的干扰，但使用电压和ECL探针可能会对细胞产生潜在影响。然而，单分子ECL为基于荧光的单分子成像方法提供了替代和补充的机会，这些方法可能被证明对生物测定和细胞成像应用有用。

参考文献：

JinrunDongetal.Directimagingofsingle-moleculeelectrochemicalreactionsinsolution.Nature,,:-.

DOI:10./s---9.

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